家蚕神经轴突导向因子Slit的功能及其进化机制研究

【摘要】神经轴突导向因子Slit是一种在进化上高度保守的分泌型糖蛋白,Slit在神经轴突导向、神经细胞迁移、神经细胞形态分化、肿瘤转移、血管生成和心脏形态发生等多种生理病理过程中发挥着重要作用。虽然Slit的功能已通过大量的遗传学实验进行了研究,但是其不同功能的分子作用机制还有待进一步研究,另外slit基因的进化机制目前还不清楚。家蚕是鳞翅目昆虫研究的典型模式种类,具有基础研究历史较长、遗传资源丰富、体型大、生命周期短、子代群体大、易于饲养和已完成基因组测序等优势。slit基因在家蚕中的功能还没有研究报道。本研究对家蚕slit基因进行了克隆,利用抗体染色和RNAi技术研究其功能,并分析了slit基因的进化以及Slit与其受体Robo的共进化。本研究有助于揭示家蚕神经、肌肉和丝腺发育的内在分子基础,同时,slit基因导向机制的研究也将为人类神经疾病、肿瘤等的预防和治疗提供理论参考。此外,Slit的进化机制研究将为轴突导向分子的进化提供理论背景。主要研究结果如下：(1)在家蚕中只有1个slit家族成员(Bmslit),采用PCR和RACE方法从家蚕大脑扩增Bmslit基因序列。Bmslit基因位于24号染色体上,包含32个外显子和31个内含子,CDS序列为4002bp,编码1333个氨基酸。多序列比对和结构域分析表明,BmSlit包含1个N末端信号肽(SP)、4个富含亮氨酸重复序列(LRR)、6个表皮生长因子样重复序列(EGF)和1个层粘连蛋白G(LamG)结构域。与果蝇Slit相比,BmSlit缺少第7个EGF结构域和C末端富含半胱氨酸序列(CT)。(2)选择BmSlit的C末端序列(BmSlit-Ct)作为抗原制备抗体。构建重组质粒pET-28a-Bmslit-Ct并在大肠杆菌BL21(DE3)进行原核表达,SDS-PAGE检测表明His-BmSlit-Ct重组蛋白以包涵体形式存在,对重组蛋白进行纯化后免疫小鼠制备多克隆抗体。ELISA和Westernblot结果表明制备的抗体能与抗原起特异免疫反应。(3)家蚕胚胎和5龄第3天幼虫的抗体染色实验发现BmSlit定位于中线胶质细胞、轴突、肌肉和丝腺,这些结果说明BmSlit可能在神经系统、肌肉和丝腺的发育中发挥作用。BmSlit与BmRobo1在轴突、肌肉和丝腺中共定位,说明在家蚕中BmSlit通过BmRobo1发挥作用。(4)采用RNAi技术研究Bmslit的功能。合成BmslitdsRNA后注射家蚕早期胚胎,以egfpdsRNA作为对照。与对照胚胎相比,BmslitRNAi胚胎中线两侧的轴突更加靠近中线。在BmslitRNAi胚胎,肌肉的排列变得不规则,一些肌肉越过中线。这些结果表明BmSlit在轴突导向和肌肉细胞从中线向两侧迁移的过程中起到排斥作用。(5)使用MEGA5.05构建基于Slit蛋白质序列的系统发生树。系统发生分析表明,slit基因起源于扁盘动物丝盘虫(Trichoplaxadhaerens),slit基因从无脊椎动物到脊椎动物发生了基因复制,家蚕Slit与果蝇等节肢动物的Slit形成一个分枝。(6)从NCBI和Ensembl数据库中收集代表物种的Slit和Robo蛋白质序列,通过MEGA5.05软件中的MUSCLE程序进行多序列比对,分析了根据实验确定的Slit和Robo的5对相互作用氨基酸在进化过程中的变化规律。结果表明,Slit和Robo的相互作用氨基酸在大多数物种中是保守的,发生改变的相互作用氨基酸表现出协调的变化,这些变化没有影响Slit和Robo之间的相互作用。这些结果说明Slit和Robo之间可能存在共进化。(7)采用镜像树法研究了Slit和Robo之间的进化相关性。通过MEGA5.05软件对脊椎动物Slit1、Slit2、Slit3、Robo1、Robo2、Robo3和对照蛋白Gapdh进行多序列比对,并构建进化距离矩阵。使用SPSS20统计分析软件计算Pearson相关系数。结果显示Robol和Robo2与3个Slit具有相似的相关系数并显著高于对照组,Robo3与3个Slit的相关系数低于Robo1和Robo2与3个Slit的相关系数,Robo3与Slitl和Slit3的相关系数显著高于对照组,Robo3与Slit2的相关系数与对照组无显著性差异。这些结果说明脊椎动物的Slit和Robo之间存在共进化。(8)根据slit和robo基因的多序列比对和进化树拓扑结构,使用PAML4.4软件中的分枝-位点模型A进行选择压力分析。在昆虫中,蚊子slit和robol同时受到了正选择,在Slit中鉴定到的3个正选择位点位于LRR结构域,在Robol中鉴定到的7个正选择位点位于Ig和FNIII结构域。在脊椎动物中,硬骨鱼的slit1、slit3、robol和robo2同时受到了正选择,在Slitl中鉴定到的18个正选择位点位于LRR1、LRR2、LRR3、LRR4、EFG2、EGF3、EGF4、EGF6、LamG、EGF9和CT结构域,在Slit3中鉴定到的54个正选择位点位于LRR1、LRR2、LRR3、LRR4、EGF1、EGF2、EGF4、EGF5、EGF6、LamG、LamG和EGF7之间的区域、EGF7、EGF7和EGF8之间的区域、EGF9以及CT结构域,在Robo1中鉴定到的1个正选择位点位于CC2和CC3之间的区域,在Robo2中鉴定到的6个正选择位点位于Ig2、FNIII-3、CC1和CC2之间的区域、CC2和CC3之间的区域。这些结果支持Slit和Robo之间的共进化。
【作者】于奇；
【导师】刘庆信；
【作者基本信息】山东农业大学，发育生物学，2014，博士
【关键词】家蚕；SIit；Robo；神经；肌肉；丝腺；进化；

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